Clonación de ADN

¿Qué es un vector de clonación de ADN?

Los vectores son fragmentos de ADN en los que se pueden insertar otros fragmentos de ADN. Estos vectores son los que podrán introducir el ADN en las células huésped. Hay algunos vectores diferentes que pueden utilizarse, como los plásmidos (de bacterias), los vectores virales (de virus), los cósmidos (un tipo de plásmido híbrido) y los cromosomas artificiales (cromosomas artificiales que contienen características deseadas).

Objetivo de la clonación del ADN

Hay múltiples razones por las que los científicos quieren utilizar la clonación de ADN:

• Producir grandes cantidades de ADN o proteínas deseadas.

• Crear ADN recombinante para estudiar cómo funcionan los genes.

• Estudiar posibles mutaciones genéticas y cómo pueden alterar la función de un gen.

• Estudiar las características de los genes.

La clonación de ADN también puede utilizarse en el campo de la medicina. Utilizando ADN recombinante, se pueden administrar proteínas humanas deseadas a células bacterianas. Las células bacterianas se vuelven capaces de cultivar estas proteínas, ¡que pueden cosecharse para medicamentos humanos! Dos ejemplos son la insulina y las hormonas del crecimiento humano.

Pasos de la clonación del ADN

Para clonar ADN, es necesario un proceso de varios pasos. Los pasos para la clonación del ADN son

1. Aislamiento del ADN deseado

2. Ligación

3. Transformación

4. Procedimiento de selección

Aislamiento del ADN deseado

Para utilizar el gen o ADN de interés, hay que aislarlo del resto del ADN. Normalmente se utiliza la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) para crear múltiples copias del ADN deseado.

Ligadura

A continuación, el ADN aislado y amplificado se colocará en un vector para crear ADN recombinante. Para ello, es necesaria la ligadura. La ligación es el proceso de unión de dos cadenas de ADN diferentes.

Hay que abrir el vector utilizando enzimas de restricción para que acepte el ADN de interés. El ADN de interés también utiliza las mismas enzimas de restricción para garantizar que sus extremos sean complementarios al vector abierto. Se utilizará otra enzima, la ADN ligasa, para unir el ADN de interés al vector, lo que creará la molécula de ADN recombinante deseada.

Transformación

A continuación, la molécula de ADN recombinante se administra a una célula huésped, normalmente se utilizan células bacterianas, especialmente E. coli. Se realiza un largo procedimiento para garantizar que las células huésped toman el ADN recombinante dado y son capaces de hacer crecer colonias que contienen este ADN deseado. En algunos casos, ¡hay que mantener estas colonias toda la noche en una incubadora!

Para asegurarse de que sólo crecen las colonias deseadas, se suelen utilizar genes de resistencia a los antibióticos. Por ejemplo, la molécula de ADN recombinante podría tener un gen de resistencia a los antibióticos para la ampicilina, y entonces las células huésped se colocan en una placa de Petri que contenga gel de agar con ampicilina. Sólo las células huésped que contengan el gen de resistencia a la ampicilina podrán crecer en la placa de Petri, lo que permite a los científicos asegurarse de que su proceso de transformación ha funcionado realmente.

Procedimiento de cribado

Por último, habrá que recoger las colonias de la placa de Petri y comprobar que tienen la inserción deseada. Normalmente, se realizará de nuevo la PCR o se utilizará el análisis de fragmentos de restricción. El análisis de fragmentos de restricción utiliza enzimas de restricción para digerir el ADN vectorial aislado. Si el ADN vectorial aislado contiene el inserto deseado, las enzimas de restricción lo eliminarán.

Después de utilizar la PCR o el análisis de fragmentos de restricción, habrá que comprobar los resultados mediante electroforesis en gel o análisis de secuencias de ADN.

La electroforesis en gel es el proceso de utilizar un gel, normalmente de agarosa, y electricidad para separar el ADN en función de su tamaño y carga. El ADN se introduce en pequeños pocillos en la parte superior del gel. Las cargas negativas, el cable negro, se producen en la parte superior del gel, y las cargas positivas, el cable rojo, se producen en la parte inferior. Como el ADN está cargado negativamente, las cargas negativas de la parte superior empujan el ADN hacia la parte inferior del gel, cargada positivamente. Cuanto menor sea el tamaño del fragmento de ADN, más lejos podrá desplazarse por el gel. El ADN deseado suele evaluarse utilizando una escalera de ADN, bandas de ADN con valores conocidos. Las bandas de ADN pueden medirse en nucleótidos (nt) o pares de bases (pb), que son iguales entre sí. Puedes ver un ejemplo de electroforesis en gel a continuación, en la Fig. 3, con la escalera de ADN a la izquierda con sus valores conocidos y tres muestras.

Figura 3. Ejemplo de electroforesis en gel. Fuente: Mckenzielower vía wizeprep.com

El análisis de la secuencia del ADN es un método capaz de evaluar la estructura nucleotídica del ADN recombinante. Hay distintos tipos de análisis de la secuencia del ADN, y el tipo elegido depende del tamaño del ADN recombinante. Hay dos tipos principales de análisis de la secuencia del ADN:

• Secuenciación Sanger: Funciona para ADN de hasta 900 pb, pero es cara e ineficaz para cualquier cosa mayor.

• Secuenciación de nueva generación: Funciona para ADN de 50-700 pb, pero es más rápida, barata y puede ejecutar múltiples secuencias a la vez, a diferencia de la secuenciación Sanger.

¿Cuáles son los métodos de clonación y ensamblaje del ADN?

Hay varias formas diferentes de clonar ADN:

• Clonación basada en enzimas de restricción: Utiliza enzimas de restricción para cortar el fragmento de ADN de interés y el vector y, a continuación, utiliza ADN ligasa para colocar el fragmento de ADN en el vector.

• Clonaciónpor PCR: Utiliza ADN ligasa para colocar fragmentos amplificados de ADN de interés en el vector. Para este proceso se necesita un vector específico de "cola en T", lo que significa que los extremos del vector deben tener ambos el nucleótido timina.

• Clonación independiente de la ligadura: Se encontrarán secuencias coincidentes tanto en el ADN de interés como en el vector, y se utilizarán enzimas para crear los extremos para el ADN de interés insertado y el vector, de modo que el paso de recocido permitirá que los extremos se cierren y creen la molécula de ADN recombinante.

• Clonación sin ligadura: Similar a la clonación independiente de la ligadura, necesita una enzima para crear los extremos del ADN de interés y el vector, pero necesita ADN polimerasa para rellenar los huecos del ADN de interés insertado y el vector y ADN ligasa para garantizar que la molécula de ADN recombinante se ha creado correctamente.

• Clonación recombinacional: Proceso de varios pasos que utiliza un vector de entrada y enzimas recombinasas de ADN. El ADN de interés se coloca en el vector de entrada. A continuación, el vector de entrada se combina con el vector de destino para formar lo que se denomina un clon de destino utilizando la ADN recombinasa.

Técnicas de clonación del ADN

Existen diferentes consejos y trucos para garantizar la eficacia de la clonación de ADN. Por ejemplo, es clave asegurarse de que el ADN no tiene contaminantes que puedan reducir los resultados finales de la clonación. Los contaminantes del ADN pueden eliminarse utilizando kits de purificación. Al realizar reacciones basadas en enzimas de restricción, es importante saber que no hay que añadir demasiadas enzimas de restricción. El volumen de enzimas de restricción no debe superar el 10% del volumen total. Además, utiliza métodos de medición cuantitativa para evaluar si hay o no la cantidad adecuada de material que se utilizará para las reacciones posteriores.