Ley de Beer-Lambert

La ley de Beer-Lambert

• Cuando el haz luminoso de un espectrofotómetro atraviesa una solución activa UV-vis, la intensidad del haz luminoso disminuye.
• La disminución de la intensidad luminosa del haz de luz al atravesar una solución también se denomina atenuación.
• Cuando la muestra absorbe la luz de un espectrofotómetro que pasa a través de una muestra, llamamos a esto absorbancia de la muestra.
• La ley de Beer-Lambert relaciona la disminución de la intensidad del haz de luz del espectrofotómetro al atravesar una muestra con la absorbancia de la muestra.
• Además, la absorbancia de la muestra se contabiliza eliminando la absorbancia debida al disolvente, como se explicará más adelante.

La intensidad de la luz que atraviesa la célula de referencia(formada sólo por el disolvente), simbolizada por _I0, se mide en cada longitud de onda, _λnm, dentro del rango de longitudes de onda del espectrómetro UV-vis ( Figura 1).

Figura 1: Montaje del experimento UV-vis para la célula de referencia.

A su vez, también se mide la intensidad de la luz que atraviesa la célula de muestra(disolvente más soluto), simbolizada por I, en cada longitud de onda, _λnm, dentro de la gama de longitudes de onda del espectrofotómetro (Figura 2).

Figura 2: Montaje del experimento UV-vis para la célula de muestra.

La luz se propaga a través de cada célula hasta el detector del espectrofotómetro. A continuación, los espectrogramas resultantes de la intensidad luminosa por longitud de onda se procesan y combinan para obtener un gráfico de la ley de Beer-Lambert, como se explicará con más detalle a continuación. Si en una determinada longitud de onda la intensidad luminosa que atraviesa la célula de muestra, I, es menor que la intensidad luminosa que atraviesa la célula de referencia, _I0, entonces la muestra ha absorbido luz en esa longitud de onda.

Gráfico de la ley de Beer-Lambert

Utilizamos la relación $\raisebox{1ex}{$I_0$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$I$}\right.$para calcular la absorbancia debida a la muestra mediante la fórmula siguiente, la fórmula de la absorbancia:

$Abs={\log }_{10}\left(\frac{I_0}{I}\right)$

La fórmula de la absorbancia considera la atenuación de la luz debida a la absorción de luz del soluto en relación con la absorción del disolvente. En las longitudes de onda de interés, en las que el disolvente no absorbe apreciablemente la luz UV-vis, pero el soluto sí absorbe fuertemente la luz, la relación de intensidad, $\raisebox{1ex}{$I_0$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$I$}\right.$sería un número mayor que uno. Es decir, al pasar por la célula de referencia llega más luz al detector, lo que da un valor elevado de $I_0$en relación con la luz que llega al detector desde la célula de muestra, que produce un valor menor de la intensidad luminosa, I, porque la muestra ha absorbido la luz que de otro modo habría llegado al detector. El trazado de la absorbancia, Abs, frente a la longitud de onda, elgráfico de Beer-Lambert, arroja picos positivos de absorbancia de la muestra en las longitudes de onda de interés, es decir, donde la relación, $\raisebox{1ex}{$I_0$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$I$}\right.$es mayor que uno, $\raisebox{1ex}{$I_0$}\!\left/ \!\raisebox{-1ex}{$I$}\right.>1$:

$Ab{s}_{wavelength}={\log }_{10}\left(\frac{I_0}{I}\right)>1\underset{}{\to }thesoluteabsorbslightatthatwavelength$

Figura 3: Gráfico de Beer-Lambert

Ecuación de la ley de Beer-Lambert

Se supone que la absorbancia debida a la muestra tiene las siguientes propiedades:

1. La absorbancia de la muestra, Abs, es directamente proporcional a la longitud del recorrido de la luz, $\mathcal{l}$a través de la cubeta.
2. La absorbancia de la muestra, Abs, es directamente proporcional a laconcentración de soluto , c.

En símbolos:

$Abs\propto \mathcal{l}\propto c\mathcal{l}$

$Abs\propto \mathcal{l}\propto c\mathcal{l}$

$Abs\propto \mathcal{l}\propto c\mathcal{l}$

$Abs\propto \mathcal{l}\propto c\mathcal{l}$

Esta relación de proporcionalidad puede convertirse en una ecuación incluyendo una constante de proporcionalidad, que llamaremos coeficiente de extinción molar, $\epsilon$lo que nos da una ecuación para la absorbancia:

$Abs=\epsilon c\mathcal{l}$

El coeficiente de extinción molar también se denomina absortividad molar. Esta ecuación para la absorbancia sólo puede utilizarse cuando se conoce el coeficiente de extinción molar $\epsilon$es conocido. Juntando todo esto se obtiene la ecuación de la ley de Beer-Lambert, que relaciona la atenuación, o disminución de la intensidad luminosa causada por la muestra, con el producto de la concentración de soluto, c, y la longitud del camino, $\mathcal{l}$a través de la cubeta:

$Abs={\log }_{10}\left(\frac{I_0}{I}\right)=\epsilon c\mathcal{l}$

Unidades de la ley de Beer-Lambert

Observamos además que las unidades dela ley de Beer-Lambert para la concentración, c, se dan normalmente en moles por litro (mol/L) y que la longitud del recorrido de la cubeta es del orden de centímetros (cm). Por tanto, las dimensiones del coeficiente de extinción $\epsilon$se dan típicamente en L^. mol-1^{. cm-1}. Además, debe tenerse en cuenta que la absorbancia, Abs, es una cantidad adimensional, de modo que una absorbancia es un número mayor que cero para los picos de interés.

Ejemplo de la ley de Beer-Lambert

Considera el siguiente ejemplo de la ley de Beer-Lambert.

Se ha preparado una solución de una enzima de interés en un tampón acuoso. Al químico le gustaría saber cómo calcular la actividad enzimática utilizando la ley de Beer-Lambert. Antes hemos señalado que la ley de Beer-Lambert se utiliza en la espectroscopia UV-vis para detectar un soluto UV-vis activo dentro de la solución de la muestra.

Así pues, la actividad de la enzima debe producir un metabolito UV-vis activo, es decir, el metabolito debe tener una absorbancia dentro del intervalo 200 nm-800 nm. El requisito de que haya un soluto activo UV-vis en una solución de muestra es un requisito de la espectroscopia UV-vis. En cuanto a la ley de Beer-Lambert de , otra limitación es que las fuerzas intermoleculares entre el soluto y el disolvente pueden cambiar al cambiar la concentración de soluto, y estos cambios en el tipo de fuerzas intermoleculares soluto/disolvente pueden afectar al gráfico de la ley de Beer-Lambert de forma no lineal.

Volviendo al experimento, el químico transfiere entonces la solución de enzima tamponada a una cubeta de cuarzo; es lo que llamaremos la cubeta de referencia, que se coloca en la ranura de la cubeta de referencia del espectrofotómetro. A continuación, se transfiere otra porción de la solución enzimática tamponada a otra cubeta de cuarzo, y se añade un compuesto metabolizado por la enzima, colocando inmediatamente el conjunto en la ranura de la cubeta de muestra. Las absorbancias, Abs, de ambas cubetas se toman de forma incremental hasta que no se produzca ningún cambio en la absorbancia del metabolito. La concentración de la solución de la muestra, c, en cada punto temporal se determina entonces mediante la ecuación de la ley de Lambert de la cerveza en la forma siguiente:

$c=\frac{Abs}{\epsilon ·\mathcal{l}}$

Se trata de una forma alternativa de la ecuación de Lambert de la cerveza utilizada para calcular la concentración de soluto (metabolito), c, en una muestra; donde, $\epsilon$es el coeficiente de extinción molar del metabolito en la solución de la muestra y, $\mathcal{l}$es la longitud del recorrido de la cubeta.

Los puntos de datos calculados de la concentración de metabolito, c, se representan en función del tiempo. A continuación, se ajusta una curva a los puntos de datos dispersos. A continuación, se determina la pendiente en una región en la que la curva ajustada es lineal. Este valor de la pendiente de una región lineal de la curva ajustada es la actividad enzimática.

Limitaciones de la ley de Beer-Lambert

A continuación se exponen algunas de las limitaciones de la ley de Beer-Lambert. La primera y más importante es que es necesario que haya un soluto UV-vis activo en la solución de la muestra para que se genere una señal de detección en un espectrofotómetro UV-vis.

Fuerzas intermoleculares

Hay que tener en cuenta que las fuerzas intermoleculares entre el soluto y el disolvente pueden cambiar a medida que cambia la concentración de soluto, y estos cambios en las interacciones intermoleculares soluto/disolvente pueden afectar al gráfico de la ley de Lambert de la cerveza de forma no lineal. Por lo tanto, es importante elegir una longitud de onda, _λnm, en el gráfico de la ley de lambert de la cerveza que muestre una respuesta lineal proporcional a los cambios en la concentración de soluto. Es decir, las longitudes de onda de interés muestran una respuesta lineal proporcional a los cambios en la concentración de soluto.