Tinción de Gram

Resultados de la tinción de Gram

Hay cuatro resultados posibles de la tinción de Gram, que nos ayudan a clasificar las bacterias. Dos son comunes y dos poco comunes. Describiremos brevemente el aspecto de cada resultado de la tinción.

Resultados comunes de la tinción de Gram

• Grampositivos

  • Al final del procedimiento de tinción de Gram, las bacterias grampositivas son de color púrpura.

• Gram-negativas

  • Al final del procedimiento de tinción de Gram, las bacterias Gram negativas son de color rosa.

Resultados poco frecuentes de la tinción de Gram

• Gram variable

  • Las bacterias Gram variables tienen un aspecto mixto púrpura y rosa

• Gram indeterminado

  • Son las bacterias que no captan bien ninguna tinción. No son ni rosas ni moradas. Son incoloras al final del proceso de tinción de Gram.

Método de tinción de Gram

Pasos de la tinción de Gram:

1. Se saca un cultivo con sustancias desconocidas para examinarlo.

2. De este cultivo se toma un frotis o muestra de bacterias.

3. Esta muestra se fija con calor.

4. Sustancia nº 1: Se añade a la muestra un colorante, elvioleta cristal.

5. Sustancia nº 2: Se añade yodo a la muestra para ayudar a que el violeta cristal se adhiera.

6. Sustancia nº 3: Se añade etanol (o acetona u otro alcohol) como agente decolorante, es decir, para lavar otros colores.

7. Sustancia nº 4: Se añade un nuevo colorante, el Safranin. Este paso se denomina contratinción.

Ya sabemos que, en general, las bacterias grampositivas se tiñen de púrpura en última instancia, y las gramnegativas, de rosa. Pero, ¿qué aspecto tienen después de cada uno de los pasos que hemos descrito anteriormente? ¿Son siempre iguales y en qué momento podemos observar su distinción cromática?

¿Cómo funciona la tinción de Gram?

La tinción de Gram tiene una lógica científica: el violeta cristal puede unirse a los peptidoglicanos presentes en la pared celular de las bacterias. En función del grosor de esta pared celular, el colorante permanecerá o no tras añadir el decolorante, condicionando el color de la bacteria: púrpura si permaneció ( violeta cristalino), y rosa si no lo hizo, debido a que la célula toma el color de la safranina.

Tinción de Gram positivos

Las bacterias grampositivas tienen una pared celular gruesa (Fig. 3). Esta pared celular se encuentra fuera de su membrana celular y está formada por un material llamado peptidoglicano (macromolécula formada por péptidos y azúcares).

Tras añadir violeta cristalino y utilizar yodo como mordiente para fijar el violeta cristalino a la bacteria, la gruesa pared celular de peptidoglicano forma un complejo sólido con el dúo violeta cristalino-yodo. A continuación, se añade el decolorante etanol. Sin embargo, como la pared de peptidoglicano es tan gruesa, en lugar de eliminar el complejo violeta cristalino-yodo, lo que ocurre es que el etanol hace que se cierren los poros presentes en la pared celular y que la propia bacteria se deshidrate y se encoja. Como los poros están cerrados, el colorante violeta cristalino no puede salir de la pared celular y ser lavado. Así, la tinción primaria púrpura permanece, incluso después de añadir el decolorante. Luego, cuando se añade la contratinción secundaria de safranina, ésta no puede fijarse en la pared celular bacteriana porque el violeta cristal ya está allí y no se ha lavado.

Tinción de Gram negativos

Las bacteriasgramnegativas, en cambio, tienen una pared celular de peptidoglicano muy fina y, fuera de esta pared celular, tienen una capa de membrana externa llena de lípidos y lipoproteínas. Cuando las bacterias gramnegativas se encuentran con el colorante violeta cristal, lo absorben y se vuelven de color púrpura, y el yodo actúa como mordiente para ayudarlas a fijar este color púrpura. Sin embargo, una vez añadido el decolorante etanol, el alcohol altera y disuelve los lípidos de la membrana externa. Con la membrana externa debilitada y sólo una fina capa de peptidoglicano, el cristal violeta puede escapar de la célula y la bacteria se vuelve incolora en esta fase. A continuación, la contratinción de safranina tiñe de rosa la pared celular Gram negativa, porque el violeta de cristal ya ha sido lavado.

Tinciónde Gram del Bacillussubtilis

El Bacillus sub tilis es nuestro organismo de ejemplo para demostrar lo que ocurre durante la tinción de Gram de los organismos grampositivos. Su género: Bacillus, nos indica que se trata de una bacteria en forma de bastoncillos. Pero, ¿de qué color aparecerían estos bastoncillos durante el proceso de tinción de Gram (Fig. 1)?

• En primer lugar, por supuesto, tomaríamos un cultivo que contuviera B. subtilis.

  • Al examinar estas bacterias al microscopio, son naturalmente incoloras.

• Después, fijamos con calor un frotis de B. subtilis.

  • No se observan cambios de color.

• Ahora, añadimos la primera sustancia: violeta de cristal.

  • El violeta cristal es un colorante que hace que las bacterias de la muestra adquieran un color púrpura.

• A continuación, añadimos la segunda sustancia: el yodo.

  • El yodo tiene naturalmente un color marrón oscuro o azul oscuro. No es un colorante, por lo que las bacterias siguen siendo moradas.

  • El yodo se considera un mordiente, lo que significa que es un agente fijador. Ayuda a fijar el color morado a las bacterias.

• Ahora, añadimos la tercera sustancia: el etanol

  • El etanol, o cualquier alcohol que se utilice en este paso, es un decolorante.

  • Sin embargo, las bacterias grampositivas como B. subtilis NO se descoloran con él. Conservan su color púrpura.

• Por último, añadimos la cuarta sustancia: la safranina

  • La safranina es el contratinte, y tiene un color rosa

  • Sin embargo, la safranina sólo puede afectar a las bacterias que se han descolorado correctamente. Como las bacterias Gram positivas NO se descolorean con etanol, no les afecta la safranina y terminan todo este proceso con un color morado.

Fig.1. Tinción de Gram de Bacillus subtilis. Puedes ver que los bastoncillos son de color morado, lo que significa que son Gram positivos.

A continuación se muestra un cuadro que resume los efectos de cada sustancia sobre los bichos grampositivos como el Bacillus subtilis (Tabla 1).

Tabla 1: Pasos de la tinción de Gram para bacterias grampositivas.

Tinción de Gram deE coli

Para nuestro ejemplo paso a paso de un organismo gramnegativo, utilizaremos otra bacteria en forma de bastoncillo: Escherichia coli (Fig. 2). La E . coli suele ser inofensiva, pero puede causar multitud de enfermedades diferentes, desde infecciones urinarias a diarrea del viajero o meningitis en recién nacidos. Los pasos para la tinción de Gram de E coliI son los mismos que para cualquier bacteria:

• Primero, cogeríamos nuestro cultivo incoloro de E . coli y lo fijaríamos con calor.

• Después aplicaríamos violeta cristal.

  • La bacteria aparecerá de color púrpura.

• A continuación, aplicaríamos nuestro mordiente, el yodo.

  • No se observará ningún cambio de color, la E . coli seguirá siendo morada.

• Después utilizaríamos nuestro lavado con etanol como decolorante.

  • Las E . coli pierden su color y se vuelven incoloras.

• Por último, aplicamos safranina, la contratinción.

  • Las E. coli toman el color de la contratinción y se vuelven rosas.

Fig. 2. Tinción de Gram de E. coli. Los bacilos son de color rosa, lo que significa que son Gram negativos.

A continuación se muestra una tabla que resume los efectos de cada sustrato sobre los bichos gramnegativos (Tabla 2).

Tabla 2: Pasos de la tinción de Gram para bacterias gramnegativas

Tinción de Gram del Staphylococcusaureus

Como otro ejemplo de bacteria Gram positiva, tenemos el Staphylococcus aureus, que como su nombre indica es una bacteria cocci. En este caso, el proceso de tinción es el mismo (violeta cristal, luego yodo, después alcohol y finalmente safranina). Sin embargo, la imagen final al microscopio mostrará esferas púrpuras en lugar de bastoncillos púrpuras como en el caso del Bacillus subtilis.

Fig. 3. Tinción de Gram de Staphylococcus aureus. Puedes ver que los cocos son de color púrpura, por lo que son Gram positivos.

Después de este artículo, esperamos que comprendas mejor la tinción de Gram: ¡cómo funciona, qué indica y cómo los colores son una parte clave de la microscopía!