Electroforesis

Tipos de electroforesis

Hay dos tipos principales de electroforesis, según se use para estudiar ácidos nucleicos o proteínas. La electroforesis de ácidos nucleicos se emplea tanto con ADN como con ARN. El tipo de electroforesis y la longitud de los fragmentos de las muestras influyen en el tipo de gel empleado. La elección de un gel adecuado es una parte integral de la electroforesis; y hay múltiples opciones: la agarosa, el agar, la poliacrilamida y los compuestos que contienen tanto agarosa como acrilamida.¹

Los geles de agarosa y poliacrilamida son los más utilizados. El gel de agarosa es el mejor para la mayoría de los ácidos nucleicos y las proteínas grandes, mientras que el gel de poliacrilamida es el mejor para los ácidos nucleicos más pequeños y la mayoría de las proteínas.³ La densidad de la agarosa depende del tamaño de los fragmentos de ADN o ARN que deban analizarse. Para los fragmentos más cortos, se utiliza una mayor concentración de agarosa al crear el gel.²

Electroforesis de ADN

La electroforesis de ADN es un tipo de electroforesis que se utiliza para identificar, cuantificar y purificar fragmentos de ADN. La electroforesis de ADN también se puede utilizar en otros contextos, como técnica complementaria de otras técnicas y métodos como la PCR, la clonación de ADN o la secuenciación de ADN.

Electroforesis de proteínas

La electroforesis de proteínas es un tipo de electroforesis que se utiliza para identificar, cuantificar y purificar péptidos y proteínas. La electroforesis de proteínas se suele utilizar en combinación con otras técnicas como la espectrometría de masas o la técnica de electrotransferencia, más conocida por su nombre en inglés western blot.

Pasos de la electroforesis

El proceso de electroforesis implica muchos pasos, que parte del uso de un gel. Aunque los geles son sólidos, son matrices porosas que permiten que las macromoléculas se desplacen a través de ellos.² Los geles pueden fabricarse en el laboratorio o comprarse ya hechos, y tienen pocillos o hendiduras en un extremo que sirven para colocar las muestras.

1. Preparación del gel: cuando el gel está listo para su uso, se coloca en una cubeta de electroforesis y se cubre con una solución tampón.² La solución tampón es la que conduce la corriente eléctrica.² El tamaño y la carga de los fragmentos de las biomoléculas que se van a analizar determina el tipo de solución tampón usada.² Se colocan electrodos positivos y negativos en los extremos opuestos del gel y se aplica una corriente eléctrica al gel para crear un campo eléctrico.²
2. Colocación de las muestras: las muestras, compuestas por varios fragmentos de biomoléculas de diferentes tamaños y concentraciones, se tiñen antes de colocarlas en el gel. El teñido permite una mejor visualización y hace que las muestras sean más pesadas para que no floten fuera de los pocillos.² Con una pipeta, se coloca en uno de los pocillos del gel un marcador de peso molecular y en el resto de los pocillos las muestras de las biomoléculas. El marcador de peso molecular se carga siempre en el primer pocillo y está compuesto por fragmentos de ADN, ARN o proteínas de longitudes conocidas.² El marcador de peso molecular sirve como una especie de regla de medir: la posición de las muestras se compara con la de los fragmentos del marcador para determinar el tamaño de las muestras.
3. Migración de las muestras: las biomoléculas migran (o se mueven) a través del gel, desplazándose hacia la carga opuesta. Por ejemplo, el ADN y el ARN están cargados negativamente, debido a las moléculas de fosfato con carga negativa de sus estructuras.¹ Por lo tanto, en la electroforesis de ácidos nucleicos, el electrodo negativo se coloca en el extremo del gel con los pocillos y el electrodo positivo se coloca en el otro extremo, para que el ADN y el ARN migren lejos de los pocillos hacia el extremo positivo. Las biomoléculas se mueven según su tamaño, y las más pequeñas migran distancias mayores (tienen menor peso). La corriente eléctrica se aplica el tiempo suficiente para permitir que los fragmentos de las biomoléculas se separen.² Si no se deja el tiempo suficiente, se producirá una separación pobre o nula de los fragmentos dentro de cada muestra. Si se deja demasiado tiempo, los fragmentos saldrán del gel y se perderán en la solución tampón.
4. Visualización de resultados: cuando se ha producido una separación adecuada de los fragmentos, el gel se retira de la cubeta electroforética y se tiñe para poder visualizar las biomoléculas. Entonces, los fragmentos de biomoléculas aparecerán como bandas y, cuanto más gruesa sea la banda, mayor será la concentración de fragmentos.

Resumen de la electroforesis

En resumen, durante la electroforesis, las biomoléculas cargadas se colocan en un gel con un campo eléctrico (Figura 3, pasos 1-3). Un extremo del gel tiene una carga positiva y el otro una carga negativa. Las biomoléculas se desplazan desde los pocillos de un extremo del gel hasta el extremo opuesto, a favor de gradiente eléctrico (Figura 3, Pasos 4-5). Las moléculas más pequeñas se desplazan más lejos.

Las biomoléculas y el gel se tiñen con colorante para permitir la visualización de las biomoléculas (Figura 3, Paso 6). Siempre se utiliza un marcador de peso molecular que se utiliza como una regla para medir el tamaño de los fragmentos. El tamaño de los fragmentos se estima en función de su ubicación respecto a los fragmentos del marcador, cuyos tamaños se conocen.