Puede que ya hayas oído hablar de animales clonados, como la oveja Dolly; pero, también, puede que no conozcas la base de estos organismos genéticamente modificados: el proceso de clonación de ADN.
La clonación de ADN es la creación de copias exactas de una cadena de ADN.
Este tipo de clonación es muy utilizada en investigación científica y en la industria farmacéutica.
Por ejemplo, ¡algunas bacterias pueden usarse como minifábricas de proteínas humanas, como la insulina!
Significado de clonación
Se trata de la creación de copias idénticas, llamadas clones, de un organismo o de una célula.
La clonación ocurre de forma natural en muchos organismos y cumple las siguientes funciones:
- Reproducción: La clonación es un tipo de reproducción asexual muy común en procariotas, en algunos eucariotas —como protistas, hongos, plantas— y, en menor medida, también en animales. De esta forma, se generan clones del organismo que dan origen a un nuevo organismo.
- Formación de células nuevas: las células individuales pueden dividirse por mitosis, creando dos células hijas idénticas a la célula madre. En organismos multicelulares, este proceso es fundamental para el crecimiento del organismo y el mantenimiento sus tejidos.
En este artículo, nos enfocaremos en la clonación artificial. Aquella que se da por procesos de ingeniería genética en laboratorios.
Tipos de clonación
La clonación artificial se usa para crear nuevos organismos (como la oveja Dolly), células, o segmentos de ADN. Aquí describimos la clonación de ADN (también llamada clonación génica o molecular), que es el proceso por el cual se generan múltiples copias de ADN, ya sean fragmentos de interés o genes completos.
Si se quieren realizar aplicaciones médicas o comerciales de un fragmento de ADN o de un gen, una vez que hemos obtenido una muestra de secuencia, es necesario obtener múltiples copias. Hay dos formas de clonar un gen: in vivo e in vitro.
- In vivo: este término, en latín, significa "dentro de lo vivo". Consiste en transferir el fragmento de ADN o gen a una célula hospedadora mediante un vector.
- In vitro: este término, en latín significa "en vidrio". Consiste en utilizar la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), un procedimiento biotecnológico que se lleva a cabo en un laboratorio.
En este artículo nos enfocaremos en la clonación in vivo.
Clonación del ADN
Para clonar el ADN existen varias técnicas; pero, en general, se necesitan dos componentes esenciales:
- Un hospedador: generalmente una bacteria o microorganismo eucariótico (como la levadura).
- Un vector: Los vectores son moléculas de ADN a los que se les pueden insertar otros fragmentos de ADN.
En términos generales, el ADN que se quiere clonar se agrega al ADN del vector, generalmente mediante reacciones enzimáticas. Cuando el ADN se inserta en el vector, se convierte en ADN recombinante. Luego, el vector sirve para transportar el ADN de interés a las células hospedadoras.
El ADN recombinante son moléculas de ADN, que se han creado en un laboratorio, a partir de ADN de diferentes fuentes.
Existen diferentes vectores que pueden utilizarse: los plásmidos (de bacterias), los vectores virales (virus), los cósmidos (un tipo de plásmido híbrido) y los cromosomas artificiales (cromosomas diseñados en laboratorio que contienen las características deseadas).
Los plásmidos son piezas de ADN de forma circular que se encuentran en muchas bacterias (pero no son cromosomas bacterianos, son moléculas extra de ADN.
Se emplean frecuentemente en la clonación génica, para realizar experimentos en laboratorio, con fines investigativos.
La siguiente figura muestra un ejemplo de plásmido.
Fig. 1: El diagrama muestra una bacteria con su cromosoma circular y varios plásmidos.
Objetivo de la clonación
Hay múltiples razones por las que los científicos utilizan la clonación de ADN:
- Producir grandes cantidades de ADN o proteínas de interés médico.
- Crear ADN recombinante para estudiar el funcionamiento de los genes.
- Estudiar posibles mutaciones genéticas y cómo pueden alterar la estructura y función de un gen.
- Estudiar las características de los genes.
En el campo de la medicina, la clonación de ADN se utiliza para producir proteínas humanas en las células bacterianas. Las células bacterianas son capaces de usar el ADN para sintetizar las proteínas correspondientes, muchas de las caules pueden ser usadas para el desarrollo de medicamentos.
Dos ejemplos de ello son la insulina y las hormonas de crecimiento humano.
La insulina fue descubierta por el investigador Frederick Grant Banting en 1921. Originalmente se obtenía del ganado vacuno y porcino, pero esta insulina provocaba ocasionalmente reacciones alérgicas en los pacientes humanos, por lo que los científicos buscaron una nueva forma de desarrollala. En 1978, una empresa médica consiguió desarrollar insulina humana, utilizando la bacteria Escherichia coli; esta llegó al mercado en 1982 con el nombre de Humulin.
Proceso de clonación del ADN
A continuación, presentamos un ejemplo de clonación de ADN, en el que se usa un plásmido como vector y una bacteria como hospedador (Fig. 2).
Fig. 2: Proceso de clonación de ADN o génica por medio de transformación bacteriana.
Aislamiento del ADN
Para poder usar el gen o el fragmento de ADN de interés, hay que aislarlo del resto del ADN. Para esto, se utilizan enzimas de restricción o endonucleasas. Las enzimas rompen la cadena en ADN en puntos específicos, reconocidos por estas endonucleasas, llamados sitios de restricción.
Formación del ADN recombinante
A continuación, el ADN aislado se coloca en el vector, para crear ADN recombinante. Se emplea la misma enzima de restricción para abrir el plásmido; pero, en este caso, hay un único sitio de restricción. Al emplear la misma enzima de restricción, se asegura que los extremos en la abertura del plásmido sean complementarios a los extremos del fragmento de ADN de interés (son extremos cohesivos). Luego, con la adición de una enzima denominada ADN ligasa —que cataliza la formación de un enlace fosfodiéster entre las bases complementarias—, los dos segmentos de ADN procederán a unirse.
Para ver este proceso en detalle, revisa nuestro artículo de ADN Recombinante.
En este proceso, se utilizan muchas copias de los plásmidos, así como del ADN de interés. Algunos plásmidos lograrán incorporar el ADN de interés, formando plásmidos de ADN recombinante; otros no lo lograrán y seguirán siendo plásmidos normales.
Transformación
La molécula de ADN recombinante se administra a una célula hospedadora, normalmente usando células bacterianas (especialmente E. coli).
La introducción de un plásmido recombinante a una bacteria se llama transformación bacteriana.
Se lleva a cabo mediante un largo procedimiento para garantizar que las células hospedadoras adquieran el ADN recombinante dado y sean capaces de reproducirse y crear colonias que contengan este ADN deseado. En algunos casos, estas colonias tendrán que mantenerse durante horas en una incubadora.
Al igual que con los plásmidos, algunas bacterias incorporarán los plásmidos recombinantes y formarán bacterias recombinantes; otras pueden incorporar plásmidos normales (no recombinantes) o no adquirir ningún plásmido.
Identificación de bacterias transformadas
Para asegurarse de que solo crezcan las colonias deseadas, se suelen utilizar genes marcadores. Entre estos están los genes de resistencia a los antibióticos, los genes de fluorescencia y los marcadores enzimáticos, entre otros. Estos genes permiten determinar si las bacetrias se han transformado exitosamente en recombinantes, o no; o si estas presentan algún grado de resistencia a los antibióticos.
Los genes marcadores son secuencias de ADN bien conocidas que se utilizan para identificar variaciones genéticas en organismos individuales o grupos de organismos. También ayudan a determinar la presencia de una característica determinada en una población.
Genes de resistencia a los antibióticos
Uno de los marcadores más utilizados son los genes de resistencia a los antibióticos.
Para verificar esto, las células hospedadoras se colocan en una placa de Petri, que contiene un gel de agar con ampicilina. Entonces, solamente las células que contengan el gen de resistencia a la ampicilina crecerán en la placa de Petri; esto permite a los científicos determinar si el proceso de transformación realmente ha funcionado.
Marcadores fluorescentes
Los genes de los marcadores fluorescentes codifican proteínas que son fluorescentes y brillan cuando absorben la luz.
Un ejemplo de ello es la proteína verde fluorescente (GFP), que se identificó por primera vez en medusas.
Cuando se añade la GFP al fragmento de ADN que contiene el gen deseado, las células que han adquirido con éxito el plásmido recombinante expresarían la GFP. Entonces, comenzarán a tornarse de un color verde fluorescente. Dado que no son necesarias las réplicas en placas, los marcadores fluorescentes facilitan el proceso de selección.
Marcadores enzimáticos
De forma similar a la GFP, podemos utilizar enzimas como la lactasa para seleccionar las células recombinantes. La enzima lactasa debe unirse a los fragmentos de ADN con el gen deseado. Las células que hayan adquirido el plásmido recombinante producirán, entonces, lactato. El lactato puede convertir un sustrato incoloro en azul. Por lo tanto, en presencia de las células recombinantes, el sustrato se volvería azul.
También se puede confirmar si el segmento de ADN se encuentra en el hospedador mediante electroforesis en gel o secuenciación del ADN.
- La electroforesis en gel es el proceso de utilizar un gel (normalmente a base de agarosa) y electricidad, para separar el ADN en función de su tamaño y carga. Cuanto menor sea el tamaño del fragmento de ADN, más lejos podrá viajar por el gel.
- La secuenciación del ADN es un método para determinar el orden de los nucleótidos del ADN recombinante.
Clonación - Puntos clave
- La clonación de ADN es la creación artificial de copias idénticas de una cadena de ADN (segmentos o un gen completo).
- La clonación de ADN, o génica, se hace con los siguientes propósitos:
Producir grandes cantidades de ADN o proteínas de interés médico.
Crear ADN recombinante para estudiar el funcionamiento de los genes.
Estudiar posibles mutaciones genéticas y cómo pueden alterar la estructura y función de un gen.
Estudiar las características de los genes.
- La clonación de ADN se realiza con métodos in vivo (transfiriendo el gen a una célula hospedadora mediante un vector), o in vitro (utilizando la reacción en cadena de la polimerasa, PCR, en el laboratorio).
- Los cuatro pasos generales del método de clonación de ADN son: aislamiento del ADN de interés y del vector con enzimas de restricción o endonucleasas, la formación del ADN recombinante con ADN ligasa, la transformación o introducción del ADN recombinante en el hospedador y la identificación de hospedadores exitosamente transformados.
- Para asegurarse de que solamente crecen las colonias deseadas y poder identificarlas, se suelen emplear genes marcadores —como genes de resistencia a los antibióticos, genes de fluorescencia, y marcadores enzimáticos—.
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