Cromatografía de capa fina

¿Qué es la cromatografía en capa fina?

Cromatografía en general es un método que utilizamos para separar los distintos componentes de una mezcla. Tiene casi 120 años de antigüedad. El funcionamiento de la cromatografía depende de las características de los distintos componentes y de su afinidad a los distintos medios. Hay varios tipos de cromatografía, como la cromatografía de gases, la cromatografía de partición, la cromatografía en columna, la cromatografía en capa fina y muchas otras.

En este artículo nos centraremos en la cromatografía en capa fina. La cromatografía en capa fina (a la que también nos referimos comúnmente como TLC para abreviar) se utiliza para separar mezclas no volátiles, utilizando una placa de TLC que tiene un material adsorbente. La TLC funciona según el principio de que un compuesto desconocido se distribuye desde la fase sólida, conocida como fase estacionaria, que está fijada en una placa fina de plástico o vidrio. Ésta se sumerge en un líquido, la fase móvil, que se desplaza sobre la placa fina. Esta fase móvil es el disolvente de elución que se desplaza por la placa de TLC. Podemos medirla para analizar y determinar un compuesto desconocido. La fase móvil puede ser un disolvente polar o no polar, y se elige en función del compuesto desconocido que intentemos identificar.

Principios de la cromatografía en capa fina

Todos los tipos de cromatografía siguen los mismos principios básicos.

1. Utilizamos un disolvente, llamado fase móvil, para disolver una muestra de una mezcla soluble. El disolvente transporta la mezcla a un medio estático llamado fase estacionaria.
2. Algunos componentes de la mezcla son transportados por el disolvente más rápidamente que otros. Decimos que los componentes que viajan más rápido tienen una mayor afinidad por la fase móvil. Así se separa la mezcla en sus componentes y se obtiene un cromatograma.
3. A continuación, utilizamos las distancias recorridas por los componentes para calcular los valores de Rf. Éstos nos ayudan a identificar el componente.

Veamos ahora cómo se aplican estos principios básicos a la cromatografía en capa fina.

Fase estacionaria

En la cromatografía en capa fina, la fase estacionaria es -como su nombre indica- una capa de gel de sílice o alúmina sobre una fina placa de plástico o metal. Enseguida veremos por qué se utiliza el gel de sílice.

Fase móvil

En la TLC, la placa de plástico o metal se coloca verticalmente en el disolvente, denominado fase móvil.

En cuanto a la fase móvil, hay muchas posibilidades: puedes utilizar alcoholes, alquenos, ¡o incluso sólo agua destilada! Todo depende de cómo disuelva el disolvente tu mezcla. Pero en la TLC, a menudo añadimos una sustancia adicional que es fluorescente a la luz ultravioleta. Esto resulta útil para ver el resultado final de la práctica, conocido como cromatograma.

Factores de retención

Podemos utilizar el cromatograma producido en TLC para calcular los valores Rf. Éstos se basan en la relación entre la distancia recorrida por cada componente de la mezcla y la distancia total recorrida por el disolvente. Para calcularlos, se divide la distancia recorrida por el componente por la distancia recorrida por el disolvente.

Los valores Rf son importantes porque cada componente tiene un valor Rf específico en unas condiciones determinadas. Entre las variables que influyen en ello están la temperatura, la fase móvil y la fase estacionaria. Pero si repitieras el experimento exactamente, obtendrías el mismo valor Rf para el mismo componente. Entonces podemos comparar los valores de Rf con los de una base de datos para identificar los componentes presentes en la mezcla.

Afinidad relativa

Los componentes con mayor afinidad por la fase móvil ascenderán más rápidamente por la placa que los que tienen mayor afinidad por la fase estacionaria. Son más solubles en el disolvente.

Por ejemplo, un componente con mayor afinidad por la fase móvil podría recorrer tres cuartas partes del camino hasta la placa en un tiempo determinado, mientras que un componente con mayor afinidad por la fase estacionaria podría recorrer sólo un tercio del camino hasta la placa. Pero, ¿qué determina su afinidad relativa?

Para entenderlo, tenemos que fijarnos en la estructura del gel de sílice. Es un tipo de dióxido de silicio. Puedes ver que está formado por una red de átomos de silicio y oxígeno, pero en el exterior de la estructura hay una capa de grupos -OH:

Fig. 1 - Gel de sílice. Anna Brewer, StudySmarter Originals

Como la superficie del gel de sílice contiene grupos -OH, puede formar enlaces de hidrógeno con compuestos o moléculas adecuados. Los enlaces de hidrógeno son un tipo de fuerza intermolecular (ver Fuerzas intermoleculares). Estos enlaces mantienen al compuesto en su sitio, impidiendo que se desplace tan rápidamente por la placa. Por tanto, podemos deducir lo siguiente:

• Las sustancias que pueden formar enlaces de hidrógeno se unirán más fuertemente al gel de sílice, por lo que tendrán una mayor afinidad por la fase estacionaria y una menor afinidad por la fase móvil. Se moverán más lentamente por la placa y darán valores de Rf más bajos. Decimos que se adsorben más.
• Las sustancias que no pueden formar enlaces de hidrógeno, se unen menos fuertemente al gel de sílice. Siguen existiendo otras fuerzas intermoleculares entre ellas y el gel de sílice, pero son más débiles que los enlaces de hidrógeno, por lo que la sustancia asciende más rápidamente por la placa. La sustancia tiene mayor afinidad por la fase móvil y menor afinidad por la placa estacionaria. Tales sustancias dan valores Rf más altos.

La alúmina funciona de forma muy parecida. También contiene grupos -OH en su superficie exterior que pueden formar enlaces de hidrógeno con las sustancias adecuadas.

Esquema de la cromatografía en capa fina

Fig. 2: Cromatografía en capa fina. Tomado de: Wikimedia Commons.

Entonces, ¿qué aspecto tiene exactamente un cromatograma en capa fina? Si nos fijamos en la imagen de la derecha, podemos ver lo que se conoce como tanque de cromatografía . Dentro del tanque podemos ver el disolvente, que es la fase móvil, la placa de TLC, que es la fase estacionaria y, por último, el frente de disolvente, que muestra la distancia que ha recorrido la fase móvil.

Ahora, puede que estés pensando, ¿qué son todos esos puntos de colores? Estos puntos representan los distintos componentes separados de una mezcla. A medida que el frente del disolvente se desplaza hacia arriba, la mezcla se separa y por eso se encuentran en puntos diferentes de la placa. Cuando dos puntos están en el mismo nivel, indica que esos dos componentes de una mezcla son idénticos.

Método de la cromatografía en capa fina

Ahora que sabemos cómo funciona la cromatografía en capa fina, podemos ver cómo se hace realmente. Empezaremos esbozando los pasos antes de explicarlos con más detalle.

1. Coge una placa de plástico o metal y extiende sobre ella una fina capa de gel de sílice o alúmina, es decir, tu fase estacionaria.
2. Traza una fina línea de lápiz en la parte inferior de la fase estacionaria y coloca un punto de tu mezcla soluble en el centro de la línea.
3. Coloca la placa verticalmente en un vaso de precipitados que contenga un pequeño volumen de tu disolvente, la fase móvil. Asegúrate de que sólo tocas la placa por los bordes y de que el nivel de disolvente está por debajo de la línea de lápiz con el punto de mezcla.
4. Forra los lados del vaso de precipitados con papel de filtro empapado en el disolvente y cubre el vaso con una tapa. Ahora deja el montaje hasta que el disolvente haya recorrido casi todo el camino hasta la parte superior de la placa.
5. Una vez que el disolvente haya llegado casi hasta la parte superior de la placa, retira la placa del vaso de precipitados y marca la posición del frente del disolvente con otra línea de lápiz. Tu cromatograma ya está listo para ser visualizado y analizado.

Aquí tienes un montaje típico para cromatografía en capa fina:

Análisis de cromatogramas

Al final de tu experimento, el montaje debería parecerse un poco a esto:

Fig. 4. Los resultados finales de la TLC.

Puedes ver que el soluto original se ha dividido en una línea vertical de manchas, cada una directamente encima de la mancha inicial de tu soluto. Cada mancha está a una distancia diferente de la línea base del lápiz. Cada mancha representa un componente distinto que se encuentra en el soluto.

Sin embargo, tu cromatograma puede tener un aspecto algo diferente. Al principio del artículo hemos hablado de cómo puede utilizarse la cromatografía para analizar componentes incoloros. Pero ¿cómo podemos verlos si son, bueno, incoloros? Aquí es donde entra en juego la sustancia fluorescente bajo la luz ultravioleta. Si tomamos nuestro cromatograma y lo iluminamos con luz UV, la parte del cromatograma que ha atravesado el disolvente brillará. Sin embargo, los puntos de los componentes que han subido por la placa no brillarán, por lo que aparecerán como manchas oscuras. Puedes rodearlas con lápiz y seguir analizando el cromatograma como de costumbre.

Otra alternativa es rociar la placa con algo que produzca un compuesto coloreado. Si, por ejemplo, sabes que tu mezcla contiene aminoácidos, puedes rociar el cromatograma terminado y seco con ninhidrina. Ésta reacciona con los aminoácidos formando compuestos de color púrpura y marrón.

Cálculo de los valores Rf

Ahora que tenemos un cromatograma y podemos ver las manchas de los componentes en la placa, podemos calcular un valor Rf para cada mancha. Recuerda que cada mancha representa un componente diferente que se encuentra en tu mezcla de partida.

1. Mide la distancia recorrida por el disolvente, desde la línea de base inferior hasta la línea superior que marcaste con lápiz al final del experimento.
2. Mide la distancia recorrida por cada componente del soluto, desde la línea de base inferior hasta el centro de la mancha, coloreada o marcada con un círculo a lápiz.
3. Divide la distancia recorrida por cada componente por la distancia total recorrida por el soluto. Éste es tu valor Rf.

\[\text{valor Rf} = \frac{{text{distancia recorrida por el soluto}}{{text{distancia recorrida por el disolvente}}]

He aquí un ejemplo, utilizando el cromatograma elaborado anteriormente.

Fig. 7. Cálculo de los valores de Rf.

Tomemos la mancha roja del ejemplo anterior. Calculemos su valor Rf.

Tenemos que dividir su distancia recorrida por la distancia recorrida por el disolvente. Estos valores son 5,8 cm y 16,8 cm respectivamente:

\[\frac{5,8}{16,8} = 0,345\]

Normalmente redondeamos los valores de Rf a dos decimales, por lo que esto nos daría un valor de 0,35.

Análisis de cromatogramas

Los cromatogramas nos muestran dos cosas:

1. El número de componentes diferentes de nuestra mezcla de partida.
2. La identidad de cada componente de nuestra mezcla de partida.

Número de componentes diferentes

Recuerda que cada mancha representa un componente distinto que se encuentra en la mezcla original del soluto. En nuestro ejemplo anterior, tenemos tres manchas diferentes en nuestro cromatograma. Por tanto, sabemos que tenemos tres sustancias diferentes presentes.

Identidad de cada componente

Hay dos formas de identificar las sustancias en un cromatograma. En primer lugar, al preparar el experimento, puedes colocar un pequeño punto de una sustancia conocida, como un aminoácido o una molécula orgánica concreta, en la línea del lápiz, al lado de tu punto de soluto. Esta sustancia conocida también será arrastrada por el disolvente hacia arriba por la placa, produciendo una mancha visible. Si alguna de las manchas de tu mezcla coincide con la mancha de la sustancia conocida, sabrás que esa sustancia está presente en tu mezcla.

¿Te parece un poco confuso? He aquí cómo se ve en la práctica:

Fig. 8. Utilización de una molécula de referencia en TLC.

La mancha verde de la izquierda es de una sustancia conocida. Una de las manchas producidas por nuestra mezcla coincide exactamente con ella. Por tanto, podemos deducir que la mezcla contiene esta sustancia concreta.

Pero hay otra forma de identificar los componentes. También hemos mencionado antes que, siempre que mantengas las mismas condiciones, un componente concreto siempre producirá el mismo valor Rf. Supongamos que un componente concreto tiene un valor Rf de 0,4. Si buscamos en una base de datos, deberíamos poder encontrar una sustancia que también produzca un valor Rf de 0,4 en las mismas condiciones: la misma fase móvil, la misma fase estacionaria y la misma temperatura. Estas dos sustancias son la misma.

Ventajas de la cromatografía en capa fina

Cuando oigas por primera vez la palabra cromatografía, es posible que pienses en los experimentos que se hacen en la escuela utilizando cromatografía en papel. Son relativamente rápidos, baratos y fáciles de realizar. Pero la cromatografía en capa fina tiene algunas ventajas sobre la cromatografía en papel.

• Funciona más rápido y puede analizar cantidades más pequeñas.
• Produce resultados más fiables, ya que las manchas se dispersan menos.
• Las placas suelen ser más resistentes que el papel utilizado en la cromatografía en papel.

Usos de la cromatografía en capa fina

Por último, veamos algunos de los usos de la cromatografía en capa fina. Al principio de este artículo, vimos cómo podemos utilizar esta técnica para ver si una reacción se ha completado. Pero hay muchas otras aplicaciones, entre ellas

• Comprobación de la pureza. La cromatografía en capa fina separa las mezclas en sus distintos componentes y, por tanto, es una forma fácil de ver si una sustancia es pura o si es una mezcla de distintos componentes.
• Identificación de compuestos, por ejemplo de aceites esenciales o moléculas orgánicas.
• Análisis bioquímico del plasma sanguíneo, el suero y la orina.